¡Hola! Soy un proveedor de TET: 213 células, y hoy te guiaré a través de cómo realizar tintas de inmunofluorescencia en estas células. La tinción de inmunofluorescencia es una técnica súper útil en el mundo de la biología celular. Nos ayuda a visualizar proteínas específicas dentro de las células, lo que nos da una mejor comprensión de sus funciones y ubicaciones.
Preparación de las células TET - 213
Lo primero es lo primero, necesitamos preparar nuestras células TET - 213. Comience por cultivarlos en un medio de cultivo apropiado. Estas células generalmente funcionan bien en un medio como RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y estreptomicina al 1%. Incubar las células a 37 ° C en una atmósfera de CO₂ al 5%.
Una vez que las células alcanzan aproximadamente 70 al 80% de confluencia, es hora de comenzar el proceso de tinción. Deberá sembrar las células en cubreobjetos en una placa de 24 pozos. Esto hace que sea más fácil manejar las células durante los pasos de tinción. Use una pipeta para transferir cuidadosamente la suspensión de la celda a los cubreobjetos. Asegúrese de distribuir las células de manera uniforme.
Fijar las celdas
Después de que las celdas se hayan unido a los cubreobjetos (generalmente después de 24 horas), es hora de arreglarlas. La fijación es crucial ya que conserva la estructura celular y mantiene las proteínas en su lugar. Puede usar un fijador como el 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Agregue suficiente PFA para cubrir las celdas en los cubreobjetos y déjelo reposar a temperatura ambiente durante unos 15 a 20 minutos.
Una vez que se realiza la fijación, lave las células tres veces con PBS. Cada lavado debe durar unos 5 minutos. Esto ayuda a eliminar cualquier exceso de fijador de las celdas.
Permeabilización
El siguiente es la permeabilización. Este paso permite que los anticuerpos ingresen a las células y se unan a las proteínas objetivo. Use un agente permeabilizador como 0.1% Triton X - 100 en PBS. Agregue la solución de permeabilización a las células y deje que se incube a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos.
Después de eso, lave las células tres veces con PBS nuevamente, al igual que en el paso anterior. Esto asegura que el agente permeabilizador se elimine por completo.
Bloqueo
El bloqueo es un paso importante para prevenir la unión no específica de los anticuerpos. Puede usar una solución de bloqueo como la albúmina de suero bovino al 5% (BSA) en PBS. Agregue la solución de bloqueo a las celdas y deje que se incube a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora.
Incubación de anticuerpos primarios
Ahora es el momento de agregar el anticuerpo primario. El anticuerpo primario es específico de la proteína que desea detectar en las células TET - 213. Diluta el anticuerpo primario en la solución de bloqueo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Retire cuidadosamente la solución de bloqueo de las células y agregue el anticuerpo primario diluido. Asegúrese de cubrir las células completamente con la solución de anticuerpos. Incubar las células con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Este largo tiempo de incubación permite que el anticuerpo se una de manera efectiva a la proteína objetivo.
Al día siguiente, lave las células tres veces con PBS, con cada lavado que dura aproximadamente 5 minutos. Esto elimina cualquier anticuerpo primario no unido.
Incubación de anticuerpos secundarios
Después de la incubación de anticuerpos primarios, es hora del anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario está marcado con un colorante fluorescente, que nos permite visualizar la proteína objetivo bajo un microscopio de fluorescencia.
Diluta el anticuerpo secundario en la solución de bloqueo según las instrucciones del fabricante. Retire el PBS de las células y agregue el anticuerpo secundario diluido. Incubar las celdas a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 - 2 horas en la oscuridad. El ambiente oscuro es importante para evitar que el tinte fluorescente se desvanezca.
Una vez que termine la incubación, lave las células tres veces con PBS, al igual que antes.
Contratisuración
La contratinción se usa para visualizar los núcleos celulares. Puede usar un tinte como DAPI (4 ', 6 - Diamidino - 2 - fenilindol). Diluta DAPI en PBS y agrégalo a las células. Deje que se incube a temperatura ambiente durante unos 5 minutos.
Después de eso, lave las células una vez más con PBS para eliminar cualquier exceso de DAPI.
Montaje
Finalmente, es hora de montar los cubreobjetos en diapositivas de microscopio. Use un medio de montaje, que ayuda a mantener las células en su lugar y también conserva la fluorescencia. Coloque cuidadosamente una gota de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio e invierta el cubreobjetos sobre la caída. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas entre el cubreobjetos y el portaobjetos.
Imagen
Ahora está listo para imaginar las células bajo un microscopio de fluorescencia. Use los filtros apropiados para visualizar las señales fluorescentes del anticuerpo secundario y el DAPI. Puede tomar varias imágenes en diferentes campos de visión para obtener una buena representación de las celdas.
Uso de péptidos relacionados en el proceso
Durante el cultivo celular y el proceso de tinción, también puede encontrar algunos péptidos útiles. Por ejemplo,(Gly14) -humanina (humano)se ha demostrado que tiene algunos efectos beneficiosos sobre la viabilidad y la función celular. Puede agregarlo al medio de cultivo para ver si afecta la expresión de proteínas que está estudiando en las células TET - 213.
Péptido de fibronectina CS1Se puede usar para cubrir los cubreobjetos antes de sembrar las células. Esto puede mejorar la unión y la propagación celular, lo que hace que el proceso de tinción sea más eficiente.
Endotelina - 1 (11 - 21)También podría desempeñar un papel en las vías de señalización dentro de las células TET - 213. Puede agregarlo al medio de cultivo y luego estudiar cómo afecta la expresión de proteína objetivo a través de la tinción de inmunofluorescencia.
Conclusión
Realizar la tinción de inmunofluorescencia en las células TET - 213 puede ser un proceso un poco difícil, pero si sigue estos pasos con cuidado, debería poder obtener excelentes resultados. Es una técnica poderosa que puede brindarle información valiosa sobre la biología de estas células.
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Referencias
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. (2002). Biología molecular de la célula. Ciencia de Garland.
- Pollard, TD y Earnshaw, WC (2004). Biología celular. Saunders.